推荐产品
公司新闻/正文
毒性研究从 2D 到 3D 系列（二）：3D 肝细胞球 1+1 大于 2 故事
1151 人阅读发布时间：2018-12-07 13:42
肝脏毒性一直是临床试验中药物失效的主要原因之一。改善临床前毒性试验可以有效的降低药物研发风险控制。而这一实验的核心往往是是否可以获取生理相关度高的毒性测试模型。三维 (3D) 微组织或球状细胞团块因其对体内环境良好的再现性和相似性，成为 3D 培养和细胞水平药物筛选的理想模型之一。在毒性研究领域，Godoy 等报道人原代肝细胞和非实质细胞共培养而成的肝微组织可用于更好地模拟人肝脏的复杂结构 。
为了获取更有效的体外毒性研究的数据，我们建立了曲格列酮和十字孢碱处理的人原代肝细胞微组织毒性测试模型（活组织）进行毒性检测，为了全面检测 3D 肝细胞的毒性作用，我们同时使用高内涵成像检测和多模式检测两种检测方式，同步获取细胞原位和蛋白表达的多维数据， 这些数据为细胞表型和潜在毒性通路研究提供了大量的信息。
本研究涵盖 3D 球培养、药物自动化处理、生化 / 成像自动化检测几个阶段。首先使用来自 InSphero 的 Gravity Plus 系统，将人原代肝细胞和非实质 kupffer 细胞使用悬滴法共培养，获得了 3D InsightTM 人肝细胞球。悬滴法培养到理想实验大小后，可将 3D 球转移到低粘附力的 384 孔 LoBase Senso 多孔板进行下一步药物处理实验。通过 JANUS 自动化系统进行微组织的肝毒性药物处理，使用不同浓度的曲格列酮和十字孢碱对肝组织进行了 24 h 药物处理。药物处理结束，微组织球上清使用多功能酶标进行生化检测，细胞球染色后使用高内涵进行细胞表型检测。
本实验使用 PerkinElmer Enspire 进行了 3D 微球上清的测试，通过光吸收检测传统的毒性指标乳酸脱氢酶（LDH）。同时，我们通过 AlphaLISA 技术，对上清中的白蛋白 (Albumin) 进行了检测。细节这里不做赘述。
本实验高内涵实验使用 Alexa Fluor 标记的麦胚凝集素（WGA）、Cell event、TMRM、SYTOX Red 等几种探针对肝细胞微球进行了标记，在 Perkinelmer operetta 系统进行成像和分析，本实验在 20x 镜下，使用高内涵共聚焦模式进行 3D 数据采集（60um 深度， 层间距 10um）后续进一步使用 Harmony 高内涵软件进行精细的数据分析，分别检测毒性作用下微组织的崩解、细胞凋亡、线粒体膜电位变化、细胞死亡几方面的指标。通过针对上清的多模式检测和肝细胞球的高内涵细胞表型分析，我们观察到很多有趣的表型。
LDH 含量变化表征肝细胞的损伤，Albumin 由健康肝细胞分泌，因此表征了健康肝细胞的代谢状态。通过不同浓度的曲格列酮和十字孢碱对肝组织进行了 24 h 药物处理，微组织上清中两者的含量提示两种药物可能具有不同的毒性作用机制。十字孢碱处理的微组织上清 LDH 呈现明确的药物剂量效应，而它对 Albumin 的分泌并没有明显影响。有趣的是，曲格列酮的影响主要作用于 Albumin 的分泌，但对上清中的 LDH 没有影响。这一结果带给我们的假设是，曲格列酮并不影响细胞膜的通透性，因此对上清中 LDH 含量没有明显影响。而它对肝细胞功能影响非常明确。相反的，十字孢碱会引起细胞膜的破损，由此引起 LDH 和 Albumin 的释放，释放在上清中 Albumin 补偿了由于毒性对肝细胞分泌 Albumin 的影响。下面我们再来看看细胞球原位的表型信息。
Alexa Fluor350 标记的麦胚凝集素（WGA）、Cell event、TMRM、SYTOX Red，分别在图上显示为 WGA 蓝色、 cell event 绿色、TMRM 橘色、 SYTOX RED 红色。分别表征毒性作用下微组织的面积和紧密程度变化、细胞凋亡、线粒体膜电位变化、细胞死亡几方面的指标。
使用 harmony 软件进行高内涵分析，本实验实验 WGA 通道进行组织分割。在组织区域测量了 TMRM、CellEvent™ 及 SYTOX® 染色的平均强度。此外，对单独的 SYTOX® 阳性细胞进行了计数。通过该分析流程，我们对线粒体膜电位、细胞凋亡、细胞死亡以及微组织降解中剂量相关的变化进行了量化，以便描述经肝毒素处理后的典型表型变化。曲格列酮和十字孢碱逐渐损坏了线粒体膜电位并诱导细胞凋亡，这可从 TMRM 强度的持续下降和 CellEvent™ 强度的上升中得出。高化合物浓度（20 µM 十字孢碱、100 µM 曲格列酮）导致微组织中细胞死亡明显增加，且死亡细胞从微组织脱离。高于 50 µM 的十字孢碱处理导致了整个微组织的解聚。以上结果进一步验证了我们基于生化实验获得的结论。
在本研究中，我们成功的建立了多维读数评估肝毒性的检测方法。结合高内涵成像和多模式检测技术，并将肝微组织作为高度生物相关的 3D 模型系统，通过对上清和 3D 肝组织检测建立了有效的临床前毒性试验模型。 在基于上清液分析中，LDH 和白蛋白分泌检测的代谢读数显示了肝微组织中的代谢变化。另一方面，微组织的高内涵分析可研究包括不同方面表型变化的细胞完整性。生化检测得到的两种药物不同的检测结果显示了多维数据检测的价值。在后续的小型成像试验中，我们检测到了微组织膜纹理的变化进一步支持了我们的设想，即不同化合物诱导肝毒性的不同机制。期待这一技术体系在未来毒性研究带来更多发现。
为了获取更有效的体外毒性研究的数据，我们建立了曲格列酮和十字孢碱处理的人原代肝细胞微组织毒性测试模型（活组织）进行毒性检测，为了全面检测 3D 肝细胞的毒性作用，我们同时使用高内涵成像检测和多模式检测两种检测方式，同步获取细胞原位和蛋白表达的多维数据， 这些数据为细胞表型和潜在毒性通路研究提供了大量的信息。
本研究涵盖 3D 球培养、药物自动化处理、生化 / 成像自动化检测几个阶段。首先使用来自 InSphero 的 Gravity Plus 系统，将人原代肝细胞和非实质 kupffer 细胞使用悬滴法共培养，获得了 3D InsightTM 人肝细胞球。悬滴法培养到理想实验大小后，可将 3D 球转移到低粘附力的 384 孔 LoBase Senso 多孔板进行下一步药物处理实验。通过 JANUS 自动化系统进行微组织的肝毒性药物处理，使用不同浓度的曲格列酮和十字孢碱对肝组织进行了 24 h 药物处理。药物处理结束，微组织球上清使用多功能酶标进行生化检测，细胞球染色后使用高内涵进行细胞表型检测。
本实验使用 PerkinElmer Enspire 进行了 3D 微球上清的测试，通过光吸收检测传统的毒性指标乳酸脱氢酶（LDH）。同时，我们通过 AlphaLISA 技术，对上清中的白蛋白 (Albumin) 进行了检测。细节这里不做赘述。
本实验高内涵实验使用 Alexa Fluor 标记的麦胚凝集素（WGA）、Cell event、TMRM、SYTOX Red 等几种探针对肝细胞微球进行了标记，在 Perkinelmer operetta 系统进行成像和分析，本实验在 20x 镜下，使用高内涵共聚焦模式进行 3D 数据采集（60um 深度， 层间距 10um）后续进一步使用 Harmony 高内涵软件进行精细的数据分析，分别检测毒性作用下微组织的崩解、细胞凋亡、线粒体膜电位变化、细胞死亡几方面的指标。通过针对上清的多模式检测和肝细胞球的高内涵细胞表型分析，我们观察到很多有趣的表型。
LDH 含量变化表征肝细胞的损伤，Albumin 由健康肝细胞分泌，因此表征了健康肝细胞的代谢状态。通过不同浓度的曲格列酮和十字孢碱对肝组织进行了 24 h 药物处理，微组织上清中两者的含量提示两种药物可能具有不同的毒性作用机制。十字孢碱处理的微组织上清 LDH 呈现明确的药物剂量效应，而它对 Albumin 的分泌并没有明显影响。有趣的是，曲格列酮的影响主要作用于 Albumin 的分泌，但对上清中的 LDH 没有影响。这一结果带给我们的假设是，曲格列酮并不影响细胞膜的通透性，因此对上清中 LDH 含量没有明显影响。而它对肝细胞功能影响非常明确。相反的，十字孢碱会引起细胞膜的破损，由此引起 LDH 和 Albumin 的释放，释放在上清中 Albumin 补偿了由于毒性对肝细胞分泌 Albumin 的影响。下面我们再来看看细胞球原位的表型信息。
Alexa Fluor350 标记的麦胚凝集素（WGA）、Cell event、TMRM、SYTOX Red，分别在图上显示为 WGA 蓝色、 cell event 绿色、TMRM 橘色、 SYTOX RED 红色。分别表征毒性作用下微组织的面积和紧密程度变化、细胞凋亡、线粒体膜电位变化、细胞死亡几方面的指标。
使用 harmony 软件进行高内涵分析，本实验实验 WGA 通道进行组织分割。在组织区域测量了 TMRM、CellEvent™ 及 SYTOX® 染色的平均强度。此外，对单独的 SYTOX® 阳性细胞进行了计数。通过该分析流程，我们对线粒体膜电位、细胞凋亡、细胞死亡以及微组织降解中剂量相关的变化进行了量化，以便描述经肝毒素处理后的典型表型变化。曲格列酮和十字孢碱逐渐损坏了线粒体膜电位并诱导细胞凋亡，这可从 TMRM 强度的持续下降和 CellEvent™ 强度的上升中得出。高化合物浓度（20 µM 十字孢碱、100 µM 曲格列酮）导致微组织中细胞死亡明显增加，且死亡细胞从微组织脱离。高于 50 µM 的十字孢碱处理导致了整个微组织的解聚。以上结果进一步验证了我们基于生化实验获得的结论。
在本研究中，我们成功的建立了多维读数评估肝毒性的检测方法。结合高内涵成像和多模式检测技术，并将肝微组织作为高度生物相关的 3D 模型系统，通过对上清和 3D 肝组织检测建立了有效的临床前毒性试验模型。 在基于上清液分析中，LDH 和白蛋白分泌检测的代谢读数显示了肝微组织中的代谢变化。另一方面，微组织的高内涵分析可研究包括不同方面表型变化的细胞完整性。生化检测得到的两种药物不同的检测结果显示了多维数据检测的价值。在后续的小型成像试验中，我们检测到了微组织膜纹理的变化进一步支持了我们的设想，即不同化合物诱导肝毒性的不同机制。期待这一技术体系在未来毒性研究带来更多发现。