毒性研究从 2D 到 3D 系列（一）：原代细胞的故事

近年，在药物研发的不同阶段，针对原代肝细胞进行体外的药物代谢和肝毒性测试的需求不同增长。由于能够全面的表达参与肝脏药物代谢过程的酶类及转运蛋白，原代肝细胞被认为是和人类肝脏生理相关度最高的测试模型。在毒性检测中，我们已经可以获取足够的高质量冻存的人的肝细胞来进行高内涵检测。这种基于图像的检测方式，可以在肝脏受损的情况的，同步检测检测多条信号通路的多种毒性作用，同时获取针对检测化合物 DE 更有意义的肝毒性数据。

原代细胞敏感度高，且存活时间有限。因此，在针对它的药物毒性研究中，凭借高内涵系统多通道共聚焦成像模式，我们可以通过方便操作的一步免洗染色法对单层铺板的细胞进行染色，同时检测三种不同药物的肝毒性作用。

为了保证原代细胞更好的细胞黏附，我们使用预先包被胶原的 cell carrier384 孔板进行实验，以 33000 每孔的密度进行铺板，过夜培养 14 hrs 后, 加入待测药物 FCCP、Tacrine、AAP 以及 DMSO 对照共孵育 24 小时。加入染料探针 Hoechst33342(细胞核染料) ，BOBOTM-3（染死细胞），MitoTracker Deep Red ( 线粒体染料) 孵育 45 mins. 最终，使用高内涵系统在 20x 放大倍率下进行自动扫描成像，并使用 harmony 软件同步进行数据分析。通过高内涵检测技术的使用，我们可以轻松检测药物作用，读取多种细胞表型数据，如细胞核大小的变化，细胞圆度的增加、甚至复杂的线粒体纹理结构变化。（如图一）。


图一

Hoechst 通道用于识别细胞核形态和大小的变化以及染色纹理的变化。MitoTracker Deep Red 可用于识别细胞的整体形态以及线粒体分布和数量的纹理变化。同时还可使用软件配置的机器自学习功能，如图二，通过 BOBO ™-3 的染色，软件中点击识别健康细胞和受损细胞，自动提取目标细胞特征，并进行分析聚类，获取最佳的量化参数，通过机器自学习功能的应用，这里软件推荐细胞核面积以及线粒体纹理作为健康和受损细胞的最佳区分参数。由于原代细胞比一般细胞系更为敏感，因此细胞群体的异质性会更强，所以在这里纹理结构的检测读值提供了比传统基于荧光强度渎值更可靠的结果。


图二

通过本次实验，获取了原代细胞针对肝毒性药物 FCCP、Tacrine、AAP 丰富的细胞表型参数及相应的药物剂量曲线。如图三。由于原代细胞本身并不增殖，细胞数在这里作为一个对照指标。三种明确的肝毒性药物作用下，肝细胞受到损伤，随着药物浓度增大，可观察到细胞圆度逐步增大。细胞受损时，细胞核发生皱缩、DNA 碎片化，因此细胞核与细胞核纹理对于毒性非常敏感，细胞核面积和细胞核 edge 纹理可以非常有效说明药物的肝毒性。线粒体对于真核细胞行使功能具有关键作用，因此我们将线粒体 hole 纹理作为指标有效指示了三种药物对线粒体分布和数量的改变。使用软件自学习功能可以批量识别复杂的表型变化，通过训练识别，给出每孔细胞的健康度比例。在这里应该注意到，由于原代细胞的敏感性，该批细胞初始死细胞率就非常高，这一软件分析结果也与镜下结果高度一致。

对于药物肝毒性的预测和了解仍然需要很多工作，很多研究表明对比传统细胞系，原代肝细胞是更为理想的毒性评价模型。高内涵成像分析技术提供了更适合原代细胞的成像和分析方案，通过免洗染色、快速低光毒性、多通道成像的特点满足原代细胞敏感、低生存率、生存时间短以及异质性的特点。同时 Operetta 高内涵分析凭借针对亚细胞结构精细的纹理分析以及机器自学习功能为三种不同肝毒性药物的毒性差异提供了可靠的分析结果。


参考文献：

1、Hewitt N et al. (2007): Primary Hepatocytes: CurrentUnderstanding of the Regulation of Metabolic Enzymesand Transporter Proteins, and Pharmaceutical Practice forthe Use of Hepatocytes in Metabolism, EnzymeInduction, Transporter, Clearance, and HepatotoxicityStudies, Drug Metabolism Reviews, 39, 159-234Abraham V et al. (2008):

2、Application of a High-ContentMultiparameter Cytotoxicity Assay to Prioritize CompoundsBased on Toxicity Potential in Humans, J. Biomol. Screen.,13, 527-537